Guillaume Rondelet est né à Montpellier le 27 septembre 1507. A 18 ans, il vint à Paris et y passa quatre années. Puis il retourna à Montpellier et y prit le grade de bachelier en médecine. Il retourna ensuite à Paris, puis s'arrêta quelque temps en Auvergne où il exerça la médecine avec succès. Il fut reçu docteur à Montpellier en 1537. Quelque temps après, sur la recommandation du chancelier de la faculté, le cardinal de Tournon le choisit comme médecin et il l'accompagna dans ses voyages, notamment en Italie et aux Pays-Bas. C'est au cours de ces voyages que Rondelet acquit beaucoup de connaissances sur le poisson. 
En 1545, il reçoit la chaire de médecine, à la mort de Pierre Laurent à la Faculté de Médecine de Montpellier où il va influencer de très nombreux scientifiques de son époque. Il participe activement à la construction d'un amphithéâtre dans la faculté que fait bâtir Henri II. Cet amphithéâtre permet à Rondelet de faire ses démonstrations par la dissection de nombreux cadavres.
Il organise le premier cours officiel de Botanique en France (1550) et sera le précurseur des herborisations dans les garrigues montpelliéraines, cévenoles et pyrénéennes. Il créa un premier jardin botanique sous la forme d’un Hortulus installé intra-muros dans la cour intérieure de l’antique Ecole de Médecine.
Il devient, en 1556, chancelier de la Faculté après la mort de Jean Schyron.
Il enseigna durant 21 ans et eut une pléiade d’élèves comme :
François Rabelais(1483-1553), Léonard Fuchs (1501-1566), Jacques Dalechamps (1513-1588), Conrad Gesner (1516-1565), Pierre Belon (1517-1560), Charles de L’Eluse (1526-1609), Mathias De Lobel (1538-1616), Léonard Rauwolf(1535-1596), Jean-Antoine Sarrasin, Félix Platter(1536-1614), Jean Bauhin(1541-1612), Gaspard Bauhin(1560-1624).
Ses ouvrages de médecine (Methodus de materia medicinali et compositione medicamentorum Palavii (1556)..), furent imprimés à son insu, ce dont il fut très fâché, car, dit Astruc, il composait avec beaucoup de précipitation, sans avoir réfléchi sur ce qu'il voulait dire, et sans avoir pensé à mettre en ordre sa matière.
Quant à son Traité sur les poissons : De piscibus marinis, libri XVIII, in quibus veræ piscium effigies expressæ sunt parut à Lyon en 1554 et 1558, il fut fort bien reçu du public. Il est composé de figures gravées sur bois, de descriptions, de remarques recueillies parmi les pêcheurs, et de notions prises des Anciens avec plus ou moins de critique. Les quatre premiers livres traitent des généralités des poissons. Presque tout est emprunté d'Aristote et de Théophraste. Le reste parle des poissons en particulier : chacun y est exposé sans ordre déterminé, si ce n'est que Rondelet sépare ceux de mer et ceux d'eau douce. Il n'y a ni genre, ni famille. Les figures, gravées sur bois, sont généralement assez bonnes. On y trouve déjà des figures de poissons qui ont ensuite assez longtemps été négligés par les naturalistes. Rondelet parle aussi de plusieurs animaux qu'on ne range plus dans la classe des poissons : à cette époque on négligeait la classification d'Aristote, et l'on plaçait parmi les poissons tout ce qui vit dans l'eau.
Les épigrammes qui accompagnent les figures sont dus à François Boussuet (1520-1572), médecin qui s’adonnait également à l’étude des sciences naturelles et à la poésie.
Contemporain de Rabelais, il est le modèle du personnage du docteur Rondibilis dans le Tiers livre de François Rabelais.
Il mourut le 30 juillet 1566.